GMI抗肺腺癌轉移的分子機制新發現：讓癌細胞綁手綁腳，使其跑不了和尚也建不了廟 2024-03-12

2023年11月，衛福部國民健康署根據前一年的癌症登記報告公布，肺癌首度超越大腸癌，成為國人最容易發生的癌症。這個新頭銜，加上蟬聯19年國人癌症死因第一的舊頭銜，使肺癌對你我得威性上升一級。同年12月，陽明交通大學傳統醫藥研究所林東毅副教授領銜發表在【Life Sciences】的「小孢子靈芝免疫調節蛋白GMI] 抗肺腺癌轉移研究成果，則是透過動物、細胞與分子機制細說明，GMI干擾下的肺腺癌細胞是如何綁手綁腳地「跑不了和尚也不了廟」，為降低肺癌威性提供了錦囊妙方。

癌轉移的每個步驟都很關鍵

轉移對於組織器官功能的破壞，是影響肺癌患者生活品質和生命長度的主因。由於肺癌的早期症狀不易察覺，五到六成患者初次被診斷出來時多半已經晚期，使得肺癌患者承擔的轉移險明顯高於其他癌症患者。

所謂「轉移」是指癌細胞從原發部位，經血液或淋巴循環，擴散到身體其他部位生長的過程。以經由血液循環轉移為例：癌細胞必須轉變成容易爬行且具侵襲性的細胞表型，才有辦法脫離原始腫瘤，穿越細胞外基質，來到血管周圍，鑽過 (滲入) 血管進入血液循環，成為所謂的「循環腫瘤細胞」。

取得入場門票之後，癌細胞還需一邊躲避白血球，一邊尋覓新生地，等到天時地利人和再黏附到血管壁上，鑽出 (滲出) 血管，穿越細胞外基層，然後才有機落腳新的組織器官，另起爐灶落地生根【圖1】。

由於癌細胞需要歷經很多步驟才能轉移成功,所以每個步驟都可以成為藥物抑制癌轉移的靶點。單獨標靶其中一個步驟,很難做到全面攔截;如果可以同時干擾好幾個關鍵步驟,層層卡關,就能把漏網之魚減至最少。本研究觀察到的GMI抗肺腺癌轉移作用,恰好就屬於後者。

 

【圖1】腫瘤轉移過程示意圖。

 

GMI怎麼「卡」肺癌轉移?

(1) GMI可以半路攔截,阻止血液循環裡的癌細胞落地生根

根據本研究的動物實驗,同樣是免疫功能正常的小鼠,同樣從尾部靜脈植入對艾瑞莎(吉非替尼)有抗藥性肺腺癌細胞LLC-1,後續有以GMI治療者 一每四天腹腔注射一次,每次劑量10mg/kg―肺臟和肝臟長出腫瘤的機會明顯低於未做治療的控制組【圖2】;即使長出瘤,瘤數量也明顯較少,分布範圍也明顯較小【圖3】。

注射到腹腔的GMI會經由腹膜微血管吸收進入血液循環,因此GMI組的腫瘤較小、較少,很可能是GMI千擾了血液循環中的肺腺癌細胞,使癌細胞穿越血管壁進到組織器官定居的能力大幅下降所致這個保作用大大削弱了肺腺癌的生命威脅一相對於控制組在癌細胞進入血液循環第31天就有小鼠死亡,不到35天就全軍覆沒,GMI組則是直到第50天仍有近七的小鼠存活【圖3】。

 

 

【圖2】以活體冷營光影系統(IVIS) 偵測肺腺癌細胞從血液循環進到小鼠器官長出腫瘤的情形。

結果顯示，GMI組的腫瘤生成率與生長速度遠遠低於控制組。

 

【圖3】小鼠尾部靜脈植入肺腥癌細胞第28天肺部長出腫瘤的情形，以及小鼠尾部靜脈植入肺腥腺癌細胞之後在不同時間節點的存活率。

結果顥示，GMI組的不只腫瘤數量少，受到腫瘤侵犯的組織面積比較小，存活期較長，存活率也比較高。

 

(2)GMI也可先下手為強,防止癌細胞脫原始瘤向外侵襲

上述實驗結果說明GMI可以在下游截血液循環裡的癌細胞,讓們敗垂成:本研究的另一個動物實驗則觀察到,GMI還能在游「綁住」欲動的肺腺癌細胞,力阻癌轉移的發生。

腫瘤裡的癌細胞連結得很緊密的,當癌轉移的開關被啟動後,癌細胞的表現型態會從排列緊密、不易移動的「上皮型」逐漸轉變成排列鬆散(容易鬆脫)、有利移(爬行)得「間質型」,藉由這個簡稱EMT的「上皮-間質轉化(epithelialmesenchymal transition程,逐漸增強癌細侵犯周邊組織的能力【圖4】。

 

【圖4】癌細胞從【上皮型】轉轉化成【間質型】，進而脫離原始腫瘤、儲備遷移力和侵襲性的過程。

 

癌細胞從穩定性高的「上皮型」轉化成侵略性強的「間質型」的過程中 (以下將此過程簡稱EMT)，細胞表面有助癌轉移的整合素 (integrin)會顯著增加細胞內部相關的蛋白分子表現也會有所改變，包括：

# 驅動EMT發生的轉錄因子 (如Slug）會被活化和增加；

# 連結細胞與細胞之間的黏附分子也從全部都是黏性高的Ｅ-鈣黏蛋白 (E-cadherin) ，開始出現黏性低的N-鈣黏蛋白 (N-cadherin) 摻雜並存;

# 細胞骨架中有助細胞維持硬度與彈性的波形蛋白 (vimentin) 也會變多。

上述這些變化都可用來評估癌轉移的動能高低。在本研究的動物實驗裡，當肺腺癌細胞 (LLC-1) 被植入皮下之後，每四天腹腔注射一次GMI (10mg/kg) 的小鼠，不只長出來的腫瘤明顯小於控制組 (意謂發生癌轉移的本錢比較少)，腫瘤組織裡和癌轉移相關的指標也明顯較少【圖5】這說明GMI有「綁住」癌細的作用,，使肺腺癌細胞比較不易取得轉移的能力。

 

 

【圖5】小鼠皮下植入肺腺癌細胞3~4週後，腫瘤組織中有助推動癌轉移發生和進行的整合素，以及反映癌細胞轉型成有利脫離原始腫瘤向外侵襲的EMT指標。結果顥示，GMI組的癌轉移動能明顥低於未做任何治療的控制組 (CTL)。

 

(3) GMI還能從中作梗：削弱癌細胞的黏附力 (抓地力) 和遷移力

本研究還通過體外實驗證明GMI能夠抑制多種「人類肺癌細胞」的遷移能力：不管是惡性度一般的A549，還是具有高度轉移性的CL1-5，抑或EGFR雙重突變對艾瑞莎有抗藥性的H1975，當它們與GMI (0.3uM)一起培養24小時之後，癌細胞的遷移能力都會大幅下降【圖6】。

 

 

【圖６】三種不同惡性度的人類肺腺癌細胞經GMI (0.3ｕＭ）處理24小時仍具有遷移能力的癌細胞數。結果顯示，癌細胞的遷移能力會因GMI的干擾而大幅降低。

 

癌細胞的遷移能力是癌轉移能否成功的重要關鍵，因為不論是癌細胞從原鄉出發「披荊斬棘」前往血管或淋巴管周邊，還是從血液循環上岸「披荊斬棘」前往新生地，都必依靠「遷移能力」穿越細胞外基質才能抵達目的地。不過癌細胞並不是想動就能動，而是需要把它的腳(偽足)「黏附」在細胞外基質上，才能一步步地往前推進【圖7】。

 

【圖7】細胞遷移的步驟。

 

換句話說，細胞遷移並不是唏壢呼嚕地滾帶爬，也不是心想事成的瞬間位，而是要踩穩這一步才有下一步的穩步爬行。因此有如抓地力的「黏附力」就成了癌細能否穿越細胞外基質關鍵，如果每次伸出腳都要搞半天才踩得穩，自然會拖慢細胞遷移的速度。此外，進到血液循環的癌細也必須發展出有如定錨作用的「再黏附力」抓住血管壁，才有辦法鑽出血管繼續未竟的轉移之業。

由此可見黏附力對癌轉移的非常重要。而根據本研究的體外實驗顯示，GMI (0.15~0.6uM) 能在2小時内對前述三種人類肺腺癌細胞的「黏附力」和「再黏力」發揮顯著的抑制作用，且效果與GMI濃度呈正相關【圖8】，說明GMI之所以既能抑制肺腺癌細遷移【圖6】，也能阻止血液中的癌細進到組織器官落地生根【圖2、圖3】，都與GMI降低癌細胞的黏附力密切相關。

 

【圖8】三種不同的惡性度的人類肺腺癌經不同濃度的GMI處理2小時仍具有黏附能力的細胞數。

結果顯示，GMI可大幅降低癌細胞的黏附力和再黏附力。

GMI怎麼「綁」肺腺癌細胞?

(1) GMI能結合癌細胞表面，由外而內直接調控

本研究的另一個實驗發現,GMI(0.3pM)在加入人類肺癌細10分鐘之後即會結合在癌細胞表面9】,這乎暗示GMI可以「由外而內」直接調控癌細胞的行為模式,讓他們想壞卻壞不太起來。

【圖9】綠色螢光為GMI，藍色為人類肺腺癌細胞A549的細胞核，紅色為細胞骨架細結構中的纖維肌動蛋白(F-actin)--- 它們會聚集在細胞前進方向的最前端，把細胞膜向外推，形成突出的絲狀偽足( filopodia)，拉動細胞往前移。相較於只有癌細胞的控制組(左圖)， 經GMI(0.3 uM) 處理10分鐘的癌細胞表面結合了許多GMI，尤其是在絲狀偽足的位置 (右圖)。

 

(2)GMI能下調千百種「蛋白」的表現量，阻擋外部誘因對於癌轉移的推進

細胞表面各式各樣的模蛋白(細胞模上的蛋白質)是細胞接收細外訊息的窗口，其表現量之高低，反映著它們對細胞行為的影響力。根據本研究對三種人類肺腺癌細胞共計5531種膜蛋白進行的分析顯示：

惡性度一般的A549細胞在GMI (0.6pM) 處理24小時後，有1868種膜蛋白的表現量顯著降低 (減少25%以上) ；換成高度轉移性的CL1-5細胞，或是EGFR雙重突對艾瑞莎有抗藥性的H1975細胞,，則分别有944種和994種膜蛋白的表現量會因GMI的介入而顯著降低【圖10A】

此結果說明GMI的確能「由外而內」調控肺腺細癌細，而且調控的細節會視肺腺癌細胞的不同而有所差異，頗有因材施教的意味。不過異中有同的是，其中106種膜蛋白不管長在這三種癌細胞的哪一個，都會被GM下調；而根據大數據分析，這106種膜蛋白同時下調最有可能的結果，就是抑制細胞移與癌轉移，與細胞和動物實驗的結果遙相呼應。

【圖10】(A) 以GMI (0.6uM) 處理人類肺腺癌細胞，24小時後表現量下降25%以上的膜蛋白數量與整合素種類。

(B) 以GMI (0.3或0.6puM )　處理人類肺腺癌細胞，2小時後細胞表面的整合素β1、αV、α5和α6表現量明顯下降，且有量效關係。

 

(3) GMI能下調整合素表現、阻止FAK活化、促進lug降解，讓癌細胞綁手綁腳

研究者進一步縮小範圍，從這106種蛋白出跟癌轉移有關的「整合素」，並且配合細胞實驗實際確認GMI的影響，結果發現共有四種整合素(β1、αV、α5和α6) 的表現量可以在2小時內被GMI (0.6HM)下調50%以上【圖10B】。

這些整合素即是癌細胞可以黏附細胞外基的主幹。當它們因為來刺激活化後，對外會連結細胞外基質裡的纖連蛋白，對內則會吸引大批蛋白聚集在它的周圍，形成可以細架聯動的黏著斑(focaladhesion)，為細胞遷移提供必要的黏附力(抓地力)【圖11】。

其中簡稱FAK的黏著斑激酶 (focal adhesion kinase) 是最早聚集到整合素周圍的蛋白質之一。當FAK與整合素結合後，會接著活化一大串的下游分子 (包括動EMT發生的轉因子Slug)，加速癌細胞的增生和轉移。

不過本研究卻發現，GMI不只能降低相關整合素的表現量，能減少FAK被活化的機會，並把Slug送進細胞的資源回收中心分解【圖12】。前兩者會抑制黏著斑的形成，使癌細胞因為黏附力不足而不易遷移；後者則會阻止癌細胞打開「上皮-間質轉化」的開關，降低癌細胞脫原始腫瘤向外侵襲的機會。兩相作用下讓肺腺癌細胞既綁手又綁腳，大大提高癌轉移的門檻和難度。

【圖11】黏著斑複合物示意圖。與細胞骨架 (肌動蛋白應力纖維) 聯動的「黏著斑」是一個大型的蛋白複合物，由位於細胞膜上的整合素、細胞外基質的纖維蛋白，以及結合在整合素上的一百多種蛋白質 (如：黏著斑激酶FAK) 共同組成。由於FAK居關鍵位，少了它將無法形成牢靠的黏著斑，癌細胞的遷移過程中就會備受阻礙。

【圖12】( A) 以GMI ( 0.6 UuM) 處理人類肺腺癌細胞，細胞內磷酸化( 活化) 的FAK 數量會隨著時間下降。(B) 以GMI (0.6uM) 處理人類肺腺癌細胞，細胞單一成分多重標靶，GMI抗肺腺癌轉移的潛力令人期

內的Slug水平隨時間下降的程度 (虛線) 遠塲超沒有GMI (實線) 的組別。

 

單一成份多重標靶，GMI 抗肺腺癌轉移的潛力今人期待

不論是以整合素、FAK、Slug為靶點，還是力阻EMT的發生，都是抗癌新藥開發的方向，而且只要做到其中一點，就會被視為極具潛力的新星。如今作為單一成分的GMI【圖13】能多點標靶【圖14】，打破許多人對於一種成分只能標靶一個靶點的刻板印象，加上先前已被證實GMI可以標靶EGFR抑制肺腺癌瘤生長，無一不正中棘手肺癌的治療需求，集如此多的功能於一身，不知該給GMI幾顆星才算足夠？

誠如本文先前所言，單獨標靶其中一個步驟很難做到全面攔截，如果可以同時干擾好幾個關鍵步驟，層層卡關，就能把漏網之魚減至最少。科學證明GMI多點標靶的抗肺轉移作用無疑提醒著我們，降低肺癌威爽脅的「新藥」其實已經近在眼前。

 

【圖13】由111個胺基酸組成的小孢子靈芝免疫調節蛋白GMI (Ganoderma microoporum immunomodulatory protein) 是一個純的蛋白質。圖為GMI在蛋白質資料庫PDB ( Protein Data Bank) 登錄的3D結構，代號3KCW。

【圖14】經本研究證明的GMI抑制肺腺癌細胞轉移的細胞分子機制。

 

原文轉載：靈芝新聞網-  GMI抗肺腺癌轉移的分子機制新發現-讓癌細胞綁手綁腳，使其跑不了和尚也建不了廟